引言

• 循环肿瘤 DNA（ctDNA）作为微创工具的临床应用
• ctDNA 来源与特点
• 本指南目的：为 ctDNA 检测临床应用提供建议

开发过程

• 遵循韩国临床实践指南制定方法
• 团队协作
  • 韩国检验医学协会临床实践指南委员会
  • 六位检验医学医师专家小组
• 文献检索
  • 预分析程序：检索 2000 年 1 月至 2022 年 7 月相关文献，最终 27 篇纳入
  • 分析方面：检索后 23 篇适合详细审查
  • 结果解释与报告：检索后 13 篇入选最终审查
• 德尔菲法完善指南
  • 首轮调查 17 条建议，6 条需二轮调查
  • 最终确定 16 条建议

预分析程序

采血时间

• 术前、放疗或化疗前采血，用于癌症诊断或进展时分子改变识别
• 治疗有反应或病情非进展时采血可能致假阴性
• 治疗后不宜立即采血，手术至少 1 - 2 周后采血

血液采集、储存与运输

• 最佳样本：血浆优于血清，提高检测灵敏度
• 采血试管与储存
  • K2 - 或 K3 - EDTA 抗凝管适合，抑制 DNase 活性
  • EDTA 管采血后 4 - 6 小时内分离血浆
  • 血浆分离延迟超 6 小时，可 4℃ 保存 1 天或用细胞保存管
• 采血量：按规定体积采血，高灵敏度检测可增加采血管数量
• 血液运输：避免震荡和温度波动，外送检测用细胞保存管并遵循储存要求

血浆制备、质量控制与储存

• 血浆制备：EDTA 管采用两步离心法，细胞保存管按厂家建议
• 血浆质量控制：肉眼观察血浆颜色，避免溶血、脂血和黄疸影响
• 血浆储存：立即冷却至 4℃，冻存至 DNA 提取，长期 - 80℃ 保存并分装

游离 DNA（cfDNA）提取、质量控制与储存

• cfDNA 提取：选择合适提取方法和试剂盒，考虑产量、纯度及工作流程
• cfDNA 质量控制：采用多种方法进行定量和分子大小检测
• cfDNA 提取物储存：- 80℃ 保存并分装，遵循试剂盒厂家建议

分析方面

目标基因

• 癌症基因组数据库助力关键驱动基因识别
• OncoKB 数据库用于确定 FDA 批准的疗法

基于下一代测序（NGS）的 ctDNA 检测

• 检测技术：PCR 法针对特定突变，NGS 技术可全面检测
• 分子条形码：引入独特分子标识符（UMIs）减少误差，但有冗余测序和定量不准确问题
• 计算机误差校正：利用生物信息学算法提高检测灵敏度
• NGS 检测性能评估：不同检测试剂盒在灵敏度和测序深度上有差异

检测验证

• 大多数 NGS - 基于 ctDNA 检测为实验室开发测试（LDT），需验证
• BloodPAC 工作组制定验证协议
• 韩国相关指南和机构提供分析和临床性能评估指导及实验室认证计划

结果解释

变异解释

• 生物学解释：依据 ACMG/AMP、ClinGen 等指南对变异进行分类
• 临床解释：采用 AMP/ASCO/CAP、ESCAT 等指南和 OncoKB 数据库对变异进行分类和注释
• 其他知识库：VICC 数据库整合多个知识库用于变异解释

体细胞变异解读

• 解读依据
  • 多数机构用2017 AMP/ASCO/CAP指南
  • 部分结合2015 ACMG/AMP等其他指南
• 解读建议
  • 结合临床与生物学解读评估体细胞变异

解读注意事项

• 低变异等位基因频率（VAF）变异
  • 解读挑战大，难区分真假变异
  • 增加测序深度助识别真变异
  • 部分驱动基因低VAF变异对靶向治疗有效
• 意义未明的克隆造血（CHIP）
  • CHIP是造血干细胞体细胞变异积累的自然衰老过程
  • 是ctDNA结果解读的重要混淆因素
  • 可通过外周血单核细胞（PBMC）配对测序或考虑片段大小的生物信息学技术区分
• 偶然发现的种系变异
  • ctDNA检测可能发现种系变异
  • 不同VAF提示不同类型变异，但不绝对
  • 疑似种系致病变异时，考虑用正常组织确认检测并提供遗传咨询
  • 按2015 ACMG/AMP指南解读，按ACMG建议报告
• 与组织分析结果不一致
  • ctDNA未检测到变异可能是假阴性
  • 中枢神经系统癌症或脑转移时，脑脊液ctDNA检测可能有信息
  • ctDNA单独检测到变异可能因肿瘤异质性，可提供额外治疗选择

结果报告

• 报告内容
  • 患者信息：姓名、性别、年龄、肿瘤类型、组织学
  • 样本信息：样本标识符、类型、采集日期
  • 变异描述：按人类基因组变异协会命名法，用批准基因符号和参考序列，可加通俗命名
  • VAF分析：估计肿瘤负担，揭示亚克隆变异，但解释需谨慎，可报告每毫升血浆突变负担
  • 临床解读：按2017 AMP/ASCO/CAP指南分四层系统，结合肿瘤类型，不做过具体药物推荐
  • 生物标志物信息：如微卫星不稳定性（MSI）和肿瘤突变负荷（TMB），但bMSI和bTMB需更多研究
• 报告建议
  • 简洁，不超两页
  • 报告变异与治疗选择的一般关联
  • 承认假阴性可能性
  • 报告特定肿瘤类型可操作基因的阴性结果
  • 包含方法学细节，如检测方法、靶向基因和区域、参考基因组、检测性能参数、质量指标和检测局限性

结论

• ctDNA是有前景的微创工具，本指南提供了ctDNA检测各方面实用建议